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黄埔军校第一期学生毕业后，以他们为骨干组建两个教导团，每团约1000多人，编制采三三制。每连有9名军官，一半左右是共产党员。这支以共产党员为核心的部队，在统一广东革命根据地的历次战役中，成为革命军中一支劲旅。这时，周恩来把平时的政治教育转变为战时政治工作，在实践中逐步创立一套新型的军队政治工作。后来毛泽东说：“那时军队设立了党代表和政治部，这种制度是中国历史上没有的，靠了这种制度使军队一新其耳目。1927年以后的红军以至今日的八路军，是继承了这种制度而加以发展的。”朱德也说：“研究党的军史时，应当从这个老根上研究起。”
周恩来解决了建立革命军队的一系列重大理论问题。关于建军的宗旨与任务，他指出：孙中山设军校是要建立“为人民所用之军队”，“军队之打仗是为人民而打的”。革命军队的任务，“是实现我们理论的先锋”。关于军队和党的关系，他指出：“革命军是党的军队，革命军的行动要依着党的政策”，革命军队“是为主义为党国而奋斗的”。关于政治思想工作，他指出：“部队政工是革命的灵魂”。“我们做政治工作的使命，对于官长官佐要巩固其革命观念。对于士兵要使之有革命常识，所以我们要认识革命化、纪律化、统一化。就系统方面说，政治部是军队组织里面的一部分，要辅助各部处的工作，以进行政治教育实施的目的。”对于军队同人民的关系，他指出：革命军队必须同人民紧密团结，革命军“是为人民解除痛苦而来，但全恃本校军队，力量太小，若无人民援助，仍不足负重大责任”。
周恩来还筹建了一支特种革命队伍——大元帅府铁甲车队。这实际上是中国共产党直接领导下的第一支革命军队。后来，这支队伍扩建成为国民革命军第四军独立团，成为北伐军的先锋。
1925年，革命军进行了两次东征，周恩来都是政治部的领导人。他规定了“不拉夫，不筹饷，不强占民房，不用军用券”等。东征军纪律严明，鸡犬不惊，当时曾有“莫走人家取门板，莫拆民房搬砖石，莫踏禾苗坏田产，莫打民间鸭和鸡”的《爱民歌》。“革命军所到之地，人民乐于贸易，自愿帮助运输并代作侦探工作，所以作战顺利，一战而克服东江，此乃中国军队第一次战时政治工作之成绩。”
在东征中，周恩来不仅取得了政治部工作的实践经验，而且有了军事指挥、后方勤务和地方行政工作的实践。
第一次东征中，他参加了进攻淡水之役。淡水是一个地势险要，易守难攻的城池，陈炯明部约4000人守城。蒋介石、周恩来等听叶剑英汇报了敌情和作成方案，详细商计了攻城计划。2月13日发起攻击，周恩来和各级党代表鼓励学生军奋勇战斗，协同粤军第二师占领了淡水。第二次东征中，周恩来参与指挥了攻打惠州城的战役。在战争的关键时刻，他命令蒋先云组织以共产党员和共青团员为骨干的敢死队强行登城。惠州攻克，取得了这次东征的决定性胜利。接着，他又与何应钦率第一师攻占海丰，同陈炯明部近万人决战于华阳、河婆一带，全歼敌中路主力。陈炯明残部退入福建，东征军入闽追歼，周恩来留在汕头主持后方工作。东征胜利结束后，他受命行政主要职务。他帮助地方建立政党、政权和工会、农会等组织，扩大了军队的群众基础。
在两次东征之间，广州发生了著名的沙基惨案。6月23日，为了声援“五卅”后上海工人的斗争，香港口广州的罢工工人和广州的工人、农民、士兵、学生10万人游行示威，经过沙面租界对岸的沙基村时，遭到英、法等国的武装镇压，死50余人，重伤170亲人。周恩来参加了群众游行队伍，3个人一排行进，机关枪扫射过来，他两边的人都中弹身亡，他得以幸免。这是他回国后领导群众斗争遇到的第一次险情。他总是勇于站在斗争的第一线。
1926年12月，周恩来离开广东到上海，任中共中央组织部秘书和中央军委委员，次年2月，任中共上海区委军委书记。
2月23日，中共中央、中共上海区委举行联席会议，决定成立特别委员会，由陈独秀、罗亦农、赵世炎。何松林（汪寿华）、尹宽、彭述之、周恩来、肖子璋组成；并决定成立以周恩来为首的特别军委，准备进行上海工人第三次武装起义。武装起义发动时，周恩来担任了总指挥。
北洋军阀驻在上海的，是毕庶澄部，约3000人，加上当地警察共5000人左右，兵力不强，军心不稳。这对于举行起义是有利的。陈独秀作为中共中央总书记、特委负责人，对于这次起义是积极的，对组织起义也提出过正确的意见。但是他认为起义是“群众的夺取武装，群众的开代表大会”，不主张组织和训练工人的武装队伍。周恩来不同，他认为敌人部队对我们能起多大作用，这取决于我们对工人的武装程度，取决于工人拥有的力量。他重视“自己的准备”，“纠察队、自卫团都有规定特别工作”，“并加暴动起来夺取武装”。周恩来根据特别军委的讨论，提出了军事工作的纲领性计划，包括建立领导机构，组织武装力量，加强队伍训练，准备武器，搜集情报，并且加强敌军工作，核心是建立一支由中共直接领导的有战斗力的武装队伍，成为武装起义的主力。他们组织了纠察队2300人，赤卫队800多人，特别队数百人。周恩来亲自到各训练地点作政治报告成进行军事训练。
上海工人第三次武装起义在1927年的3月21日发动了，整个行动，由特委会议指挥，紧急时由罗亦农、周恩来、何松林（汪寿华）、陈独秀捐挥。周恩来分工在南市指挥，后来又到闸北前线。他身穿灰布棉袍，头戴鸭舌帽，在总指挥部对着地图同赵世炎边商量，边决定，听取报告，指示行动。经过28小时战斗，攻下北洋军阀在上海的最后一个据点——北火车站。起义取得了胜利，完全是靠有织织的产业工人武装作战，打败了几千反动军警。这是中国工人阶级依靠自己的力量武装起义胜利的光辉一页。
工人起义胜利了，蒋介石等率北伐军进入了上海市，却准备着对起义的工人阶级下毒手。4月11日夜到12日凌晨，他们用阴谋诡计缴了工人纠察队的械，13日，开始了疯狂的屠杀和搜捕。昔日的盟友彻底地露出了反动面目，是一个狠毒凶残的刽子手。大批共产党员和工人群众倒在血泊中，中国共产党的组织被迫转入地下。周恩来起草了电报，与赵世炎、罗亦农、陈延年、李立三、尹宽联名致中共中央，主张迅速出师讨伐蒋介石。电报中分析了军事力量对比，认为蒋介石处于不利地位。“为全局计，政治不宜再缓和妥协”。但这一建议未为苏联顾问鲍罗廷和陈独秀所采纳。
1927年5月下旬，周恩来由上海秘密到达中共中央所在地武汉。此前，在汉口召开的中共第五次全国代表大会上，周恩来被选为中央委员；在五届一中全会上，又被选为中央政治局委员。25日，中央政治局常委会议决定周恩来任中共中央军事部部长，必要时参加常委会议。29日，中央政治局常委会议决定周恩来代理中央常委职务，参加中央核心领导。从此以后，在长达半个世纪的时间内，周恩来一直是中共中央的主要领导人之一。
周恩来领导军事部后，以聂荣臻、王一飞、颜昌颐、欧阳钦等为助手，进行了对军队的组织、联络，加强了军队的政治工作，向国民革命军中派去朱德、陈毅、刘伯承等不少干部，并负责指导武汉的工人纠察队和湖南、广东的农民运动。这时，国民革命军独立第十四师师长夏斗寅在宜昌发动的武装叛变虽已击退，长沙许克祥又发动了反革命的“马日事变”，武汉汪精卫叛变革命的迹象越来越明显，周恩来主张在农民运动力量强大的湖南农村发动武装起义。6月17日，他在中共中央常委会上提出，现在湖南18县有8000枝枪，可以派人去集中起来，攻取反动力量弱的城池，计划取湘潭，集中浏阳、平江，省委下设军委，各区设农军委员会，在可能范围内成立乡村的临时委员会，对许多反动军队强则扰之，弱则缴其械。会议同意了这一布置。20日，周恩来在中共中央常委会上又说：湖南省委决定派50人回去，把湖南划为10个区，派10名懂军事的干部去，作好准备，根据政治局决定进行暴动。但这些意见遭到共产国际代表的反对，没有实现，陈独秀在7月5日的中央常委会上甚至说：军事工作应该收缩。
7月15日，汪精卫背叛孙中山的国共合作政策。他同蒋介石一样，对共产党员和革命群众进行大屠杀。
中国共产党决定举行南昌起义。
南昌起义的建议最早是谁提出来的？是周恩来。周恩来讲过这个过程，南昌起义的提出是这样的：“那时，军委想可否搞个起义，主要是鲍罗廷跟加伦说可以搞个起义，国际决定上没有。”而周恩来当时正是军委领导人。这时间是在7月中旬。根据这个考虑，周恩来向在军委工作的几个同志布置，指定贺昌、颜昌颐、聂荣臻组成前敌军委，聂荣臻为书记，任务是先到九江去，通知同志们了解这个意图，作为起义的准备。什么时候发难，要听中央的命令。
7月26日，周恩来由陈赓陪同到九江，27日到南昌。当时，中共临时中央常委会议已经正式决定，成立由周恩来、李立三、恽代英、彭湃组成的中共前敌委员会，周恩来为前委书记，用国民党革命委员会的名义在南昌举行武装起义。
8月1日凌晨，周恩来和贺龙、叶挺、朱德、刘伯承等领导在中国共产党掌握和影响下的国民革命军2万余人举行起义。经过几个小时的激烈战斗，全歼驻南昌国民党军3000余人，于拂晓占领南昌。
南昌起义开始了中国共产党独立地领导革命武装斗争和创建人民革命